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Das Hämochromatosegen HFE und dessen Mutationen Die enge Assoziation der Hämochromatose mit dem auf Chromosom 6 lokalisierten Oberflächenantigen HLA-A3 ist bereits seit über 20 Jahren bekannt. Trotz intensiver Bemühungen gelang die Identifizierung und Lokalisation des Hämochromatosegens HFE jedoch erst im Jahr 1996 durch eine amerikanische Firma. In der Basensequenz des HFE-Gens finden sich zwei Punktmutationen. Diese führen zu einem Austausch der Aminosäure Cystein gegen Tyrosin an Position 282 (C282Y-Mutation) sowie der Aminosäure Histidin gegen Asparaginsäure an Position 63 des HFE-Proteins (H63D-Mutation) (Abbildung 1). Die C282Y-Mutation kann bei etwa 4-9% der Normalbevölkerung heterozygot nachgewiesen werden (Überträger der Hämochromatose). Sie findet sich in Bevölkerungsgruppen europäischer Abstammung und scheint keltischen Ursprungs zu sein. Die H63D-Mutation ist dagegen auch in anderen Populationen weit verbreitet und tritt bei etwa 17% der Normalbevölkerung heterozygot auf. Aufgrund des unterschiedlichen Ursprungs werden die beiden HFE-Mutationen nicht gemeinsam auf einem Chromosom beobachtet. Umfangreiche Untersuchungen an Hämochromatosepatienten lassen erkennen, daß für die Ausbildung der Erkrankung in der Regel HFE-Mutationen beider Chromosomen notwendig sind. Bei 80-90% der betroffenen Patienten findet sich eine homozygote C282Y-Mutation, während bei etwa 4-5% jeweils eine C282Y- und H63D-Mutation der Chromosomen ("gemischt bzw. compound heterozygot") nachgewiesen werden kann (Tabelle 1). Die H63D-Mutation scheint allerdings eine untergeordnete Rolle zu spielen und lediglich in Kombination mit der C282Y-Mutation von Bedeutung zu sein. So gelten homozygote Anlageträger der H63D-Mutation (etwa 3% der Bevölkerung) nicht als Risikogruppe für die Ausbildung einer Hämochromatose. Als Folge der Mutationen wird eine Funktionsminderung oder ein Funktionsverlust des HFE-Proteins vermutet. Durch welchen Mechanismus das intakte HFE-Protein den Eisenstoffwechsel beeinflußt und warum HFE-Mutationen zur Hämochromatose führen, ist jedoch nicht bekannt. Nachweis der Hämochromatose-Mutationen (HFE-Genotypisierung) Die HFE-Mutationen lassen sich durch ein einfaches und kostengünstiges Verfahren nachweisen. Als Untersuchungsmaterial dient genomische DNA des Patienten, die zuvor aus Vollblut isoliert wird. Zunächst wird ein DNA-Abschnitt verfielfältigt, der die zu untersuchende Mutation enthält. Als Verfahren wird dabei die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt. Den Abschnitt flankierende Primer binden an die zuvor mit hoher Temperatur in Einzelstränge aufgespaltene DNA. Sie dienen dem Enzym DNA-Polymerase als Startsignal zur DNA-Synthese. Auf diese Weise wird jeweils ein neuer DNA-Doppelstrang synthetisiert und die DNA-Menge verdoppelt (Abbildung 2). Mindestens 30 Wiederholungen (Zyklen) dieses Vorganges sind notwendig, damit der zu untersuchende DNA-Abschnitt in der Elektophorese sichtbar wird. Zum Nachweis der C282Y-Mutation wird das PCR-Produkt mit dem Restriktionsenzym Sna B1 inkubiert. Ist eine C282Y-Mutation vorhanden, findet sich eine veränderte Basensequenz (G-A-Austausch an Position 845 der kodierenden Region), die das Restriktionsenzym erkennt und daraufhin die DNA spaltet. Der Wildtyp ohne C282Y-Mutation bietet dem Restriktionsenzym dagegen keine Schnittstelle, so daß auch keine Spaltung erfolgt. Die Spaltprodukte lassen sich anschließend mittels Elektrophorese auftrennen. Bei fehlender C282Y-Mutation ist lediglich ein Fragment nachweisbar (keine Spaltung). Eine homozygote C282Y-Mutation läßt sich durch zwei kürzere Fragmente erkennen (Spaltung beider Allele), während bei einer heterozygoten C282Y-Mutation alle drei Fragmente sichtbar werden (Spaltung lediglich des einen mutierten Allels) (Abbildung 3). |
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